喻新建主任团队研究成果发表：组织流式检测可快速准确鉴定肿瘤细胞表面靶抗原
研究简介
研究方法
2017年10月至2020年6月共纳入了68例无骨髓（BM）和浆膜腔积液（SCE）侵犯的R/R B细胞恶性肿瘤患者，采用细针或粗针穿刺活检获取新鲜肿瘤组织标本，在CAR-T治疗前进行靶抗原鉴定。
具体方法为：将组织标本放入含2%胎牛血清的生理盐水，迅速送至FCM实验室，并立即处理。从组织中分离出细胞，制成细胞悬液，细胞浓度为104/ml~106/ml。细胞悬液制备流程见图1。
图1 细胞悬液制备流程
标准抗体panels包含前体B细胞的CD10/CD20/CD34/CD19/CD38/CD45，以及成熟B细胞的κ/λ/CD10/CD19/CD20/CD38/CD45。同时可根据患者初始诊断的免疫表型添加其他抗体。抗原表达、部分表达、不表达分别定义为表达细胞比例＞80%、20%~80%和＜20%。
研究结果
1、基线资料
68例患者中，1例标本仅有细胞碎片、无细胞，4例无肿瘤细胞，最终63例标本满足FCM分析条件。
63例患者中，11例为B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）；52例为B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL），包括34例弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、13例伯基特淋巴瘤和5例其他类型淋巴瘤。中位年龄41岁（1~71岁），包括47例成人、16例儿童（18岁以下）。所有患者均为多线治疗失败，经治方案包括化疗、局部放疗、干细胞移植、抗体类免疫治疗或CAR-T。
2、检测结果
获取细胞：42例患者的组织标本来源于体表肿块，21例源于内部器官；43例采用细针穿刺，20例经粗针穿刺。从这些组织标本中获取的细胞数量从每管1000个到大于100000个不等（5例<5000、17例>100000）；可用于分析的肿瘤细胞占比为0.03％~99.44％（5例<5％、13例>90％）。
抗原表达：除了1例既往接受过CD19 CAR-T治疗的B-ALL患者以外，其余62例患者均表达CD19。11例B-ALL患者、10例B-NHL患者不表达或部分表达CD20。2例B-ALL患者、7例B-NHL患者部分表达CD22。见图2和图3。
图2 患者CD19/CD20/CD22表达情况
图3 肿瘤组织细胞CD19/CD20/CD22表达流式细胞图
FCM与IHC一致性：63例组织标本中，46例同期送检了IHC染色、检测CD19/CD20/CD22表达，其中1例未找到肿瘤细胞。
在45例同时具有FCM和IHC检测结果（两种方法的结果判定标准相同）患者中，CD19、CD20、CD22表达结果一致率分别为93.3% (42/45)、84.4% (38/45)和88.9% (40/45)。
部分CD20/CD22 不一致的原因主要在于：用于IHC检测的CD20/CD22抗体可以同时检测胞膜和胞浆内的抗原；而用于FCM检测的抗体可以只检测胞膜上的抗原，因此FCM可以更准确地指导CAR-T的靶点选择。
研究解读
准确鉴定靶抗原——CAR-T治疗的关键
近年来，CAR-T被广泛应用于R/R B细胞恶性肿瘤治疗，包括B-ALL、B-NHL。CAR-T靶点的选择，取决于肿瘤细胞靶抗原的表达特征。因此，准确鉴定肿瘤细胞上靶抗原的表达水平，对于CAR-T的疗效至关重要。如果靶抗原不表达或仅部分表达，则CAR-T会无效或疗效有限。尤其是既往接受过抗体免疫治疗或CAR-T治疗的患者，常常存在相关抗原的丢失或减少，准确的抗原鉴定尤为关键。
破解IHC耗时长，组织FCM另辟蹊径
肿瘤细胞表面靶抗原鉴定通常是对液体标本（BM或SCE）进行多参数FCM检测，或对组织标本进行IHC染色检测。然而，部分R/R B细胞恶性肿瘤患者仅有髓外病灶，BM和SCE中没有肿瘤细胞，无法进行常规流式分析。由于肿瘤进展迅速，这些患者急需尽快获知CAR-T靶抗原、尽早治疗，而IHC检测费时、常需等待数天。
组织FCM分析已与形态学检查一起被用于淋巴瘤诊断，通常采用外科活检或穿刺活检。本研究创新性利用穿刺标本快速鉴定肿瘤细胞CD抗原，为CAR-T治疗选择靶点提供依据。所有FCM结果在<4～6小时即可获得，远远快于耗时数天的IHC染色，且更准确。
掌握技术要点，确保组织FCM成功率
从组织中分离细胞，酶处理法和物理机械法均是可行的。酶解消化法（胰蛋白酶、胃蛋白酶或胶原酶）会增加组织细胞释放，但常常导致细胞高损伤、低存活，因此其适用于组织标本充裕的情况。
为了从有限的穿刺标本中获取更多细胞，本研究采用了柔和的机械技术，利用注射器活塞轻柔地按压组织，并用生理盐水反复冲洗。
此外，将穿刺标本置于含胎牛血清的生理盐水妥善保存并及时送到实验室，以及实验室收到标本后马上处理，均有利于保留更多的活细胞。
这一改良的流程使得高达92.6%（63/68）的标本都具有充足的细胞进行FCM分析。4例无肿瘤细胞的标本，可能的确是没有肿瘤细胞，也可能是有限的肿瘤细胞被破坏或溶解。
匠心独运，流式新用：发挥独特优势，高效助力CAR-T
从本研究数据可以看到，并非所有R/R B细胞恶性肿瘤患者均高表达CD19/CD20/CD22。单一靶点的CAR-T治疗常常难以维持长期缓解，通过不同靶点联合的CAR-T有望延长患者生存。因此，肿瘤细胞抗原鉴定对于临床医生选择单靶、双靶甚至三靶的CAR-T治疗策略十分重要。
FCM在CAR-T治疗全程都可发挥重要作用。抗原表达检测方面，除用于治疗前的靶点筛选以外，FCM对CAR-T之后序贯治疗方案的选择也能够提供有效帮助。
综上，正确选择靶抗原是R/R B细胞恶性肿瘤患者有效CAR-T治疗的基础，尤其是对于既往接受过抗体或CAR-T治疗的患者。
这一利用组织进行FCM检测肿瘤细胞靶抗原的改良方法，为BM、SCE无侵犯的R/R B细胞恶性肿瘤患者CAR-T治疗提供了快速（<4～6小时）、准确的抗原鉴定，为肿瘤快速进展的患者前移了宝贵的治疗时机。
此项技术也可以拓展至其他抗原检测（如CD79b、BCMA或CD7），从而为相应的CAR-T和抗体免疫治疗提供高效支持。
参考文献
[1] Xinjian Yu，et al. Cytometry B Clin Cytom，2022 Feb 18. doi: 10.1002/cyto.b.22060. Online ahead of print.